Introducción
La Salmonella es un patógeno Gram-negativo causante de enfermedades como fiebre tifoidea y gastroenteritis. Existen alrededor de 2600 serovares de Salmonella que pertenecen a dos especies: Salmonella bongori y Salmonella enterica; esta última es la más relevante en humanos y animales y contiene serovares móviles (con flagelo) y no móviles (sin flagelo). Particularmente, el serovar Gallinarum es específico de aves de corral y contiene dos biovares que rara vez generan enfermedades en humanos, estos son el biovar Pullorum (S. Pullorum), que afecta aves jóvenes (principalmente pollitos) causando la pulorosis aviar y el biovar Gallinarum (S. Gallinarum biovar Gallinarum), causante de la tifosis aviar en aves adultas y jóvenes (Dávila Morán & Ortiz de la Cruz, 2022).
El impacto de estas dos enfermedades en la industria avícola es alto, debido a que las tasas de mortalidad en aves jóvenes son cercanas al 100% y la bacteria se transmite de forma horizontal y vertical (Figura 1b) (Dávila Morán & Ortiz de la Cruz, 2022), por lo que una vez que la enfermedad se presenta en un galpón se disemina rápidamente a otros galpones cercanos (Bacilar, 2009; ICA, 2023). Además, la desinfección de Salmonella representa un reto para los granjeros debido a la capacidad de estas bacterias para formar biopelículas que les confiere resistencia frente a procesos mecánicos y agentes químicos (Ohashi et al., 2022).
En consecuencia, aunque la pulorosis y la tifosis fueron erradicadas en países como EE.UU y Canadá, persisten en países de América Central, Sudamérica, África y Asia (Figura 1c). Estas enfermedades afectan económicamente a productores grandes y pequeños, ya que los métodos para romper el ciclo de infección requieren cuarentenas, sacrificio, mejoras en la bioseguridad, reemplazo de gallinas e inmunización (Dávila Morán & Ortiz de la Cruz, 2022; ICA, 2023).
a. Tendencia de consumo de pollo por habitante en comparación con el de otros tipos de proteína animal en Colombia; b. Principales enfermedades en aves de corral, se resaltan la pulorosis y la tifosis aviar por sus altas tasas de mortalidad; c. Prevalencia mundial de Salmonella Gallinarum, diferenciando la prevalencia de los biovares causantes de la pulorosis (bvSP) y de la tifosis aviar (bvSG) en muestras principalmente obtenidas de aves de corral; d. Alternativas no antibióticas de tratamiento de Salmonelosis aviar.
Para evitar estos costos, antibióticos como aminoglucósidos, fluoroquinolonas y β-lactámicos son aplicados en la industria avícola como mecanismo de prevención y control de las infecciones intestinales o sistémicas causadas por Salmonella; incluso, a bajas concentraciones estos medicamentos se usan para mejorar el crecimiento y supervivencia de las aves (Abd El-Hack et al., 2022; Dávila Morán & Ortiz de la Cruz, 2022). Desafortunadamente, el uso indiscriminado de los antibióticos ha contribuido a la resistencia bacteriana en el entorno avícola (Grünberg, 2020), incluso con aparición de resistencia emergente de S. Pullorum y S. Gallinarum biovar Gallinarum frente a antibióticos como ampicilina, gentamicina, ciprofloxacina y enrofloxacina (Farhat et al., 2023). En consecuencia, se ha generado una creciente presión del mercado para reducir el uso de antibióticos que ha llevado a mayor investigación sobre soluciones alternativas menos asociadas al desarrollo de resistencia, contexto en el cual, los aceites esenciales han cobrado interés (Abd El-Hack et al., 2022) (Figura 1d).
En este estudio se evaluó la presencia de Salmonella no móvil en aves de corral, la susceptibilidad antimicrobiana y el efecto de distintos aceites esenciales disponibles comercialmente en Colombia frente a Salmonella no móvil.
Materiales y Métodos
Aislamiento e identificación de Salmonella spp. en aves de corral
Entre enero de 2019 y abril de 2021 se analizaron muestras de órganos de aves de corral que llegaron de granjas colombianas al laboratorio SERVET S.A.S siguiendo las normativas internacionales ISO 6579:2017; NTC 4574 y OIE (Capítulo 3.9.8 Salmonelosis). Los órganos muestreados y el proceso de tratamiento y análisis se resumen en la Figura 2.
a) Proceso de siembra de los órganos característicos de cada línea comercial de aves y aislamiento bacteriano, con los aislados se realizaron pruebas bioquímicas de identificación, serotipificación y antibiograma (elaboración propia-uso de Biorender); en el panel inferior se muestran órganos con signos de enfermedad: b) Hígado con tamaño aumentado y petequias; c) Bazo con tamaño aumentado y aspecto friable; d) Hígado hemorrágico; e) Saco vitelino con coloración verdosa.
Antibiograma en aislados Salmonella no móvil
La susceptibilidad antibiótica de los aislados recolectados se evaluó mediante el ensayo de Kirby-Bauer, siguiendo los lineamientos del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012). Para esto, un inóculo bacteriano de ~2×109 UFC/mL se sembró de forma masiva en agar Mueller-Hinton (MHA) con un hisopo estéril. Luego, sensidiscos con diferentes concentraciones de 10 antibióticos de uso común fueron puestos sobre el agar, incluyendo un sensidisco sin antibiótico como control negativo. Las cajas fueron incubadas a 37 ºC de 18 a 24 h y se evalúo el halo de inhibición de acuerdo con el manual del CLSI.
Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales frente Salmonella no móvil
Se evaluó la actividad antibacteriana de 11 aceites esenciales disueltos al 15% en aceite de ajonjolí frente a S. Pullorum ATCC 13036 por el método de difusión en agar como se describió para los antibióticos con algunas modificaciones (CLSI, 2012). Se realizó una siembra masiva en MHA a partir de una suspensión de ~2 x 109 UFC/mL y se pusieron seis discos por caja de papel filtro de 6 mm de diámetro impregnados con 10 μL de los aceites a evaluar. Se incluyó un disco sin aceite y otro con aceite de ajonjolí (solvente) como controles negativos y otro impregnado con ciprofloxacina como control positivo. Luego de incubar los agares a 37 º C por 24 h, se interpretó cualquier halo de inhibición como indicativo de actividad antibacteriana.
Resultados y discusión
Presencia de Salmonella spp. y Salmonella no móvil en granjas avícolas colombianas
Entre enero de 2019 y abril de 2021, en el laboratorio microbiológico SERVET S.A.S, se analizaron aves provenientes de 2952 galpones avícolas, de las cuales se obtuvieron 6052 aislados bacterianos. De estos, 267 fueron identificados como Salmonella spp.: 134 en 2019, 91 en 2020 y 42 para los primeros cuatro meses del año 2021. De esta manera, Salmonella spp. representó el 4,4% del total de los aislados recolectados y la presencia en el 9% de los galpones analizados.
De los aislados de Salmonella spp., cerca de la mitad (48%, n=129) fueron clasificados como Salmonella no móvil (Figura 3a). De esta manera, el 4,4% de los galpones analizados y al menos 52 granjas fueron positivas para la presencia de Salmonella no móvil. Además, es de notar que la distinción por años entre Salmonella móvil e inmóvil sugiere que con el paso del tiempo se ha venido controlando la presencia de Salmonella móvil en la industria avícola, mientras que la no móvil se mantiene (Figura 3b).
Para los años 2019 y 2020 se evidenció la presencia predominante de Salmonella no móvil en aves de postura, también conocidas como ponedoras comerciales, con cifras considerablemente más bajas en las líneas de engorde y reproductoras (Figura 4). De acuerdo con el ICA en 2006 se produjo en Colombia el primer brote grave de salmonelosis en ponedoras comerciales de huevos marrones de consumo. Posteriormente, entre 2008 y 2012, 35 muestras recolectadas en granjas comerciales de ponedoras en los departamentos de Cundinamarca, Santander, Bolívar y San Andrés resultaron positivas para Salmonella enterica, 16 identificadas como Salmonella móvil y 13 como no móvil (ICA, 2023), proporción similar a la encontrada en nuestro estudio para móviles e inmóviles. En conjunto, estos resultados marcan la importancia de controlar la presencia de Salmonella no móvil; por un lado, para prevenir las altas tasas de mortalidad en las aves por pulorosis y/o tifosis y por otro lado, por la relevancia gubernamental de estas dos enfermedades, dado que su impacto puede afectar el comercio avícola internacional (ICA, 2023). Además, dada la importancia de los huevos como la proteína más asequible y económica del mercado (Figura 1a), la predominante presencia de Salmonella no móvil en ponedoras comerciales conlleva a implicaciones económicas significativas, ya que la tifosis y la pulorosis están asociadas con la reducción en la producción y calidad de huevos (CLSI, 2012).
a) Distribución porcentual en el periodo de observación. b) Distribución del número de aislados por año de observación.
Resistencia antibiótica de Salmonella no móvil
Los antibióticos son el tratamiento principal contra enfermedades infecciosas, pero la rápida aparición de resistencia bacteriana compromete su efectividad (Castro-Vargas et al., 2020). De los 129 aislados de Salmonella no móvil que se evaluaron frente a antibióticos de uso común, solo uno mostró susceptibilidad frente a penicilina (Figura 5). Adicionalmente, a partir del 2020 se encontraron aislados con resistencia a por lo menos un segundo antibiótico como amoxicilina, ciprofloxacina, florfenicol, norfloxacina y gentamicina, lo que refleja una tendencia hacia la multidrogorresistencia, comportamiento que ha encendido las alarmas en otros países con porcentajes de aislados multirresistentes de Salmonella no móvil entre 12,1 % y 100% (Farhat et al., 2023).
Actividad antimicrobiana de aceites esenciales comerciales contra Salmonella no móvil
En Colombia, el ICA incentiva el desarrollo de alternativas no antibióticas para control de la Salmonelosis en la industria pecuaria (ICA, 2023), entre ellas, se han buscado alternativas que involucran la síntesis de nuevos componentes o la purificación de productos naturales como extractos vegetales o sus aceites esenciales. Todo esto, en busca de moléculas antibacterianas efectivas con menor capacidad de generar resistencia (Rubio-Ortega et al., 2018). En este estudio, se usó la cepa S. Pullorum ATCC 13036 y cinco aislados de Salmonella no móvil de aves de corral seleccionados al azar para evaluar el efecto antibacteriano de 11 aceites esenciales con actividad antimicrobiana reportada en literatura: orégano, romero, ruda, tomillo, tea tree, canela, limón, cannabis, eucalipto, hinojo (Carson et al., 2006; Coy Barrera & Eunice Acosta, 2013; Grande et al., 2023; Montero-Recalde et al., 2017; Monyela et al., 2024; Pino et al., 2014; Vignola et al., 2020; Wen-Rui et al., 2014). Pese a reportes previos, solo el aceite de canela presentó actividad antimicrobiana contra Salmonella no móvil, evidenciada por un halo de inhibición con diámetro promedio de 25,2 ± 0,3 mm, halo comparable al obtenido con 5 µg del antibiótico ciprofloxacina (24,2 ± 0,4 mm) (Figura 6). Basados en estos resultados, se ensayaron dos marcas más de aceite de canela, entre ellas la distribuida por Sigma Aldrich (Cinnamon bark oil FCC), encontrado halos de inhibición de 14mm para los dos aceites de canela probados. Estos datos evidencian la capacidad de distintos aceites de canela comerciales para inhibir el crecimiento Salmonella no móvil, conjunto de bacterias de gran importancia en la industria avícola.
Aunque se sabe que la actividad del aceite esencial puede variar por cambios en las concentraciones empleadas, métodos de extracción, parte de la planta utilizada, origen, metodología o capacidad de difusión del agente (Ezzaky et al., 2023), nuestros resultados son comparables con los de otros aceites de canela, para los cuales se han reportado halos de inhibición entre 11 y 21 mm frente Salmonella Choleraesuis y S. Typhimurium a concentraciones entre 10 y 30% de aceite (Montero-Recalde et al., 2017) o de 26 mm frente a S. Typhimurium con aceite puro (Ezzaky et al., 2023; Vepstaite-Monstavice et al., 2023). Particularmente, frente a S. Gallinarum biovar Gallinarum se han hallado halos de 27,7 mm con aceite puro (Chahbi et al., 2020), por lo que la actividad del aceite probado por nosotros al 15%, sugiere de forma preliminar, que este aceite de canela puede ser una opción interesante para el control de la tifosis y pulorosis en aves.
Lectura en mm de halos de inhibición con sensidiscos impregnados de aceites esenciales al 15%. Control negativo (Neg) y control positivo (C+). El aceite de ajonjolí fue el medio de dilución para los 11 aceites evaluados.
PE (Penicilina 10 μg); AM (Amoxicilina 10 μg); CPX (Ciprofloxacina 5 μg); FL (Florfenicol 30 μg); NOR (Norfloxacina 10 μg); ENR (Enrofloxacina 5 μg); FOS (Fosfomicina 50 μg); TRIS (Trimetoprim/sulfa 1/25 μg); TXT (Tetraciclina 30 μg) Y GENT (Gentamicina 10 μg).
Conclusiones
Salmonella no móvil representó 48% de los casos de salmonelosis, afectando principalmente a las aves del sistema productivo de postura, demostrando así, la importancia de implementar un tratamiento efectivo y a tiempo para contrarrestar los signos clínicos y mortalidad debidas a la tifosis aviar y la pulorosis.
Además, el análisis de resistencia antibiótica reveló una preocupante tendencia hacia la multirresistencia, con aislados resistentes a penicilina y otros antibióticos de uso común, lo que plantea riesgos para la salud animal y pública. En este contexto, el aceite esencial de canela evaluado aquí es una alternativa efectiva de fácil obtención en Colombia y bajo costo que podría contribuir al control de las enfermedades avícolas causadas por Salmonella no móvil. Sin embargo, para determinar la utilidad de este aceite como alternativa terapéutica, se requiere evaluar el perfil de efectividad y seguridad con otros estudios in vitro y con pruebas en el modelo animal avícola. Adicionalmente, se recomienda el estudio comparativo de varios aceites disponibles comercialmente en Colombia con el fin de seleccionar el que pueda ser más efectivo y económico.
Agradecimientos
Al laboratorio microbiológico SERVET S.A.S, por los datos y aislados suministrados para los ensayos de actividad. Parte de estos resultados corresponden al trabajo de grado de maestría de la autora principal de este manuscrito que se tituló “Alternativa terapéutica en la industria avícola: uso de aceites esenciales sobre Salmonella no móviles aisladas de aves de corral” publicada en el repositorio de la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. Adicionalmente agradecemos a la Asociación Colombiana de Médicos Veterinarios y Zootecnistas especialistas en avicultura-Amevea por su aporte en la financiación de la evaluación de la actividad antimicrobiana de los aceites mediante el Fondo de apoyo a la investigación Amevea – Dr. Pedro Villegas.
Referencias
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Lady Maricell Casallas Rodríguez +
Bacterióloga, M.Sc, Docente Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca.
Adriana Barreto-Santamaría +
Licenciada en Química, M.Sc, Estudiante doctoral, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana.
Mateo Arévalo-Yazzo
Estudiante de Microbiología industrial, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana. arevalog@javeriana.edu.co
Jairo Humberto Rodríguez
Gerente Laboratorio de Servicios Microbiológicos Veterinarios SERVET S.A.S.
Darwin Andrés Moreno Pérez
Biólogo, M.Sc., P.hD, Profesor, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Programa de MV. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales [U.D.C.A].
Mayra Díaz
MV, M.Sc., P.hD, Profesor, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Programa de Zootecnia. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales [U.D.C.A]
Gabriela Arévalo-Pinzón
Bacterióloga, M.Sc., Ph.D Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Grupo de Investigación en Ciencias del Laboratorio Clínico.
