1. Introducción
Mycoplasma spp. es una bacteria de la clase Mollicutes, que se caracteriza por no tener pared celular, poseer un genoma pequeño que codifica entre 500 y 1000 genes y un mínimo de organelas para sobrevivir, incluyendo una membrana plasmática, ribosomas y un genoma DNA circular de doble cadena (Bradbury, 2005; Gautier-Bouchardon, 2018). Se conocen un total de 25 especies de micoplasmas en aves de corral, dentro de los cuales Mycoplasma gallisepticum (Mg), M. synoviae (Ms), M. meleagridis (Mm) y M. iowae (Mi) son patogénicos. Dentro de estos Mg y Ms se consideran los más importantes debido a su efectos en la salud y producción de las aves (Yadav et al., 2022). Mg se caracteriza por causar un cuadro clínico respiratorio con presentación de estertores traqueales, descarga nasal y tos; el consumo de alimento se reduce, lo que resulta en pérdida de peso y disminución en la producción de huevos. La infección por Ms a su vez, es considerada como una infección subclínica del tracto respiratorio superior; sin embargo, en algunos casos los animales tienen estertores leves y se pueden observar las crestas pálidas o de color rojo azulado. De igual manera, se reportan cojeras y retardo del crecimiento acompañados con depresión y deshidratación. Incluso, las aves pueden presentar infecciones asintomáticas, lo que puede llegar a complicar la identificación de la enfermedad (Feberwee et al., 2022; Ferguson–Noel et al., 2020; Nascimento et al., 2005). Las infecciones por ambas especies representan un reto sanitario de importancia en la avicultura colombiana debido a los efectos sistémicos que ocasiona la enfermedad. Estos micoplasmas afectan más a aves como las reproductoras y las ponedoras comerciales y en menor medida, a los pollos de engorde. En cuanto a la transmisión del agente, esta puede ocurrir tanto de forma vertical como horizontal. Debido a que la mortalidad no es alta pero la morbilidad si, las pérdidas económicas se dan principalmente por la disminución en la conversión alimenticia, una menor calidad del huevo y aumento en la susceptibilidad a coinfecciones con otras bacterias y virus (Ferguson-Noel, 2013; Razin et al., 1998). Igualmente, estos se asocian con la presentación de la Enfermedad Respiratoria Crónica (ERC), ya que se consideran la puerta de entrada a otros agentes infecciosos como los que ocasionan la Enfermedad de Newcastle, la Bronquitis infecciosa aviar, la Laringotraqueitis aviar y/o Colibacilosis (Kleven, 1998; Michiels et al., 2016). De esta manera, la micoplasmosis afecta la viabilidad de lotes y aumenta las penalizaciones en canal (OMSA, 2021).
1Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá DC, Colombia.
*Correo de correspondencia: gcramirezn@unal.edu.co
Adicionalmente, las consecuencias de la infección por micoplasmas se relaciona con su capacidad de evadir el sistema inmune de las aves asociado a la variación antigénica de sus proteínas de superficie (Citti et al., 2010; Khiari & Mardassi, 2012). Con respecto a lo anterior, en la Figura 1 se muestra una representación esquemática del mecanismo de variación del gen vlhA de Ms, el cual codifica para la hemaglutinina, una de las principales proteínas de superficie celular (Citti et al., 2010). En este caso, el gen tiene dos regiones: una que se expresa y otra que no. En la región que no se expresa se encuentran los pseudogenes que para ser expresados deben establecerse en la región que sí se expresa. Esto puede ocurrir mediante un proceso llamado recombinación unidireccional, el cual consiste en que los psudogenes pasan a la región menos variable y se insertan en el gen que codifica para la hemaglutinina y por lo tanto, cada copia de vlhA será diferente (Citti et al., 2010). En el caso de Mg, dependiendo de la cepa, la especie tiene en su genoma 32 a 70 copias del gen vlhA en donde cada copia se va a encargar de generar variantes de la lipoproteína de superficie, contribuyendo así a la variación antigénica de la especie (Papazisi et al., 2003). Es importante resaltar que debido a las características del genoma de Mg y Ms se han reportado variantes genéticas con antigenicidad, patogenicidad y transmisibilidad con diferencias muy marcadas entre ellas, permitiendo el establecimiento de genotipos con una distribución geográfica específica (Armour et al., 2013; Kreizinger et al., 2018).
Un punto importante del estudio fueron los hallazgos en el grupo de Mg-Ms, en el cual se logró obtener ambos perfiles en dos muestras, las cuales corresponden al genotipo de ST5 (vacunal) para el esquema Mg y una ST nueva para Ms. Aunque en este estudio se trabajó con pooles de muestras, lo que impide afirmar coinfección a nivel individual, estos hallazgos evidencian que, a pesar de la vacunación contra Mg, Ms también está presente en las granjas avícolas, incluso en sistemas de producción tecnificados como el de reproductoras y por lo tanto, la circulación de ambas especies en las granjas está ocurriendo.
También es importante mencionar la identificación de la ST43 en dos muestras de este estudio que no presentan ninguna relación con cepas vacunales. La ST43 corresponde a un aislamiento en pollo de engorde y ponedoras comerciales de los países europeos Hungría, Rumania y Ucrania (Jolley et al., 2018) y su relevancia radica en que corresponde a una cepa de campo de la cual se desconoce su patogenicidad y por tanto debería estudiarse en el país.
Un aspecto muy relevante se relaciona con la necesidad de realizar un diagnóstico temprano y preciso de la enfermedad, lo cual es fundamental para su control en las granjas avícolas. Como prueba de oro se establece el cultivo de los micoplasmas cuya estrategia se ejemplifica en la Figura 2. Sin embargo, este proceso es dispendioso y puede tomar mucho tiempo, afectando así la toma de decisiones para establecer y/o ajustar las medidas de control establecidas (Feberwee et al., 2022; Kleven, 2008). Por otro lado, el uso de pruebas serológicas, como la ELISA y la inhibición de la hemaglutinación, permiten detectar respuesta inmune como resultado de la exposición a estos patógenos. Sin embargo, estas pruebas no permiten diferenciar entre cepas de campo y vacunales, por tal razón se requiere de alternativas como las técnicas moleculares, tales como la PCR en tiempo real (qPCR) y la PCR de punto final junto con la secuenciación genética, herramientas que permiten no solo diferenciar entre cepas de campo y vacunales (Dijkman et al., 2017; Raviv et al., 2008), sino que además hacen posible identificar perfiles de resistencia antimicrobiana (Lysnyansky et al., 2013; Reinhardt et al., 2002). La implementación de sistemas de monitoreo basado en estas tecnologías puede mejorar la detección temprana y la respuesta sanitaria, ante posibles brotes de la enfermedad en el país, por lo que se recomienda su implementación.
A pesar de que se cuenta con estos métodos, es necesario recurrir a procedimientos adicionales para lograr la caracterización de genotipos de micoplasmas. Para esto, se hace uso de otras técnicas moleculares como la tipificación de secuencias multilocus (MLST, por sus siglas en inglés), la cual ha permitido una mejor comprensión de la diversidad genética de ambos micoplasmas empleando un grupo de entre cinco y diez genes housekeeping, es decir que son conservados y no presentan una alta tasa de variación (Bekő et al., 2019; El-Gazzar et al., 2017; Enright & Spratt, 1999). Estos métodos tienen como ventaja que no requieren el aislamiento en cultivo in vitro y representan un nuevo enfoque para el estudio de la epidemiología molecular de los agentes bacterianos ya que, al estudiar varios genes ofrece ventajas sobre estudios moleculares basados en un único gen (Maiden, 2006; Yadav et al., 2022).
En cuanto a las estrategias de control, estas se basan principalmente en la administración de vacunas vivas atenuadas y uso de antibióticos. Las principales cepas vacunales para Mg disponibles en el mercado son la ts-11, 6/85 y F. Recientemente, se ha producido la ts-304, dirigida contra Mg asociándose a una reducción de la incidencia y severidad de la enfermedad (Kulappu Arachchige et al., 2021), mientras que para Ms se utiliza la vacuna MS-H (Klose et al., 2022). Estas vacunas tienen una distribución y uso a nivel mundial, lo que ha llevado a que las técnicas de diferenciación de cepas de campo de las vacunales tengan una gran relevancia (Armour et al., 2013; Omotainse et al., 2022). Por otro lado, los antibióticos también se emplean como tratamiento habitual de la micoplasmosis aviar; sin embargo, estos microorganismos son intrínsecamente resistentes a todos los antimicrobianos que tienen como objetivo diana la pared celular, como la fosfomicina, los glucopéptidos o los betalactámicos (Gautier-Bouchardon, 2018). Por lo tanto, solo se utilizan algunos como las tetraciclinas, los macrólidos (tilosina, tilmicosina) y más recientemente, las fluoroquinolonas (enrofloxacina, difloxacina) y las pleuromutilinas (tiamulina) (Nhung et al., 2017).
Sin embargo, los micoplasmas han presentado genotipos de resistencia a estos antibióticos en donde destacan los asociados a fluoroquinolonas ya que, junto a los macrólidos son antibióticos ampliamente utilizados en la avicultura (Gerchman et al., 2008, 2011), a pesar de que en muchos países se encuentra regulado y restringido el uso de las fluoroquinolonas en animales para consumo humano (Yadav et al., 2022). En cuanto a la resistencia a las fluoroquinolonas, esta se asocia principalmente a mutaciones en genes que codifican las subunidades de las enzimas diana del antibiótico, la DNA girasa y la topoisomerasa IV, las cuales son esenciales para la replicación del DNA (Lysnyansky et al., 2008).
En el caso de Mg, para que se presente resistencia a las fluoroquinolonas se necesitan varias mutaciones tanto en la DNA-girasa como en la topoisomerasa IV (Gautier-Bouchardon, 2018), mientras que para Ms solo es necesaria una mutación en el gen parC de la topoisomerasa IV (Lysnyansky et al., 2013).
Teniendo en cuenta lo anterior y el escaso conocimiento de las características moleculares de los micoplasmas que afectan la avicultura comercial en Colombia, se llevó a cabo un estudio analizando muestras provenientes de aves comerciales de diferentes regiones del país, con el propósito de determinar los genotipos tanto de M. gallisepticum como de M. synoviae y realizar el primer tamizaje de genes asociados con resistencia antimicrobiana en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas (QRDR).
2. Materiales y Métodos
Para este estudio se empleó un muestreo por conveniencia, seleccionando pooles de ADN del banco de muestras del servicio de diagnóstico del Laboratorio de Biología Molecular y Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia (UNAL), recibidas entre 2019 y 2023. Las muestras provenían de hisopados traqueales, pulmonares, de líquido sinovial y de tarjetas FTA. Con base en esta información, se seleccionaron 90 pooles que contaran con datos completos sobre su procedencia a nivel departamental, tipo de producción (reproductoras, ponedoras comerciales o pollo de engorde) y edad de las aves. Estos pooles se distribuyeron en tres grupos de trabajo: 30 con detección únicamente de Mg, 30 con detección únicamente de Ms y 30 con detección simultánea de ambas especies. La Figura 3, muestra una representación esquemática del flujo de trabajo.
Posteriormente, se escogieron esquemas MLST previamente reportados, en donde se seleccionó uno de seis genes housekeeping para Mg y otro esquema de siete genes para Ms (Bekő et al., 2019; El-Gazzar et al., 2017). Como se muestra en Figura 4, la detección de cada gen se realizó por medio de PCR punto final, la secuenciación mediante la técnica de Sanger y mediante análisis bioinformático se establecieron los respectivos perfiles alélicos al compararlos en la base de datos PubMLST.
En cuanto a los análisis para establecer presencia de genotipos de resistencia a fluoroquinolonas, este se llevó a cabo en 14 muestras que obtuvieron el perfil completo por MLST. En este caso, se procesaron siete muestras de Mg y siete de Ms a las que se evaluaron dos genes asociados con la síntesis de proteínas bacteriana, gyrA y parC. Como se muestra en la Figura 5, la detección de los genes se realizó mediante PCR punto final, seguida de la secuenciación individual de cada gen, mediante la técnica de Sanger. A partir de las secuencias de nucleótidos, se efectuó la traducción a aminoácidos y un alineamiento múltiple de secuencias, a través del cual se identificaron mutaciones previamente reportadas en la literatura científica.
3. Resultados y discusión
3.1 Tres nuevos genotipos de Mg fueron identificados en muestras de aves en Colombia
Como resultado de este estudio se identificaron tres nuevos genotipos de Mg (ST) en seis muestras los cuales se evidencian en la Figura 6. Estas nuevas ST sugieren la circulación de cepas de campo junto a las cepas vacunales en las granjas avícolas ya que no se encuentran relacionadas entre sí.
Desafortunadamente, la falta de información respecto a la presencia o no de signos clínicos al momento de la toma de las muestras no permite asociar estos genotipos con cuadros de enfermedad en los animales. Por otro lado, y como podría esperarse, la mayoría de las muestras (n=11) se identificaron como genotipos asociados a la cepa F vacunal (ST5). Lo anterior era de esperarse teniendo en cuenta que la cepa vacunal F es utilizada en los programas de control tanto en aves reproductoras como ponedoras y, por lo tanto, se considera normal que exista una alta circulación de la ST5. Es importante resaltar que, a pesar de que con la vacunación se busca generar un desplazamiento de las cepas de campo (Ishfaq et al., 2020; ter Veen et al., 2021), los resultados del estudio muestran que hay circulación de genotipos de campo de Mg en el país.
3.2 Ms presenta una alta variabilidad genética y 14 nuevos genotipos no reportados previamente
El panorama de Ms es muy diferente al de Mg, como se muestra en la Figura 7 se observa la alta variabilidad genética que tiene esta especie. En este caso se obtuvieron 16 perfiles alélicos, los cuales todos corresponden a nuevos genotipos que no se han reportado previamente, dos tuvieron perfil alélico idéntico y ninguno se relacionó con cepas vacunales, la cual corresponde a la ST2 (Jolley et al., 2018). Esto indica que existe una gran variedad de genotipos de esta especie circulando en Colombia. Lo anterior puede estar relacionado, posiblemente con la no utilización de vacuna contra Ms antes del 2012 en el país, permitiendo una alta circulación de cepas de campo y poco control de la transmisión de la enfermedad (Ventura et al., 2012). Sin embargo, aunque la vacuna contra Ms se empezó a administrar después del 2016 en el territorio, posiblemente, a diferencia de la cepa F de Mg, esta cepa vacunal de Ms no se ha establecido en campo.
Por otro lado, al igual que en el caso de Mg, no es posible establecer su patogenicidad debido a la falta de información de signos clínicos. Adicionalmente, en el caso de Ms se emplea la vacuna viva MS-H, la cual es termosensible y requiere un manejo específico para su conservación y administración, por lo que es necesario considerar factores que puedan afectar su estabilidad (Dijkman et al., 2017; Feberwee et al., 2009, 2017). En este orden de ideas, es importante poder establecer el por qué existe la circulación de estos genotipos en Colombia, determinar cómo se dió la entrada al país e incluso entender su patogenicidad, para lo cual sería necesario el cultivo in vitro de las bacterias de manera que se puedan realizar estudios fenotípicos, así como estudios adicionales de genotipificación ya que este tipo de información es escasa en las bases de datos no solo a nivel nacional sino global.
3.3 Los resultados en el grupo Mg-Ms sugieren circulación de ambos micoplasmas en granjas avícolas de nuestro país
Un punto importante del estudio fueron los hallazgos en el grupo de Mg-Ms, en el cual se logró obtener ambos perfiles en dos muestras, las cuales corresponden al genotipo de ST5 (vacunal) para el esquema Mg y una ST nueva para Ms. Aunque en este estudio se trabajó con pooles de muestras, lo que impide afirmar coinfección a nivel individual, estos hallazgos evidencian que, a pesar de la vacunación contra Mg, Ms también está presente en las granjas avícolas, incluso en sistemas de producción tecnificados como el de reproductoras y por lo tanto, la circulación de ambas especies en las granjas está ocurriendo.
También es importante mencionar la identificación de la ST43 en dos muestras de este estudio que no presentan ninguna relación con cepas vacunales. La ST43 corresponde a un aislamiento en pollo de engorde y ponedoras comerciales de los países europeos Hungría, Rumania y Ucrania (Jolley et al., 2018) y su relevancia radica en que corresponde a una cepa de campo de la cual se desconoce su patogenicidad y por tanto debería estudiarse en el país.
3.4 Los resultados sugieren presencia de genotipos de resistencia a fluoroquinolonas en cepas de campo de micoplasma que circulan en el país
La segunda parte del estudio fue identificar genotipos de RAM en las muestras, específicamente a las fluoroquinolonas. Para el caso de las muestras de Mg, independientemente si correspondieron al grupo único o al de detección simultánea, se detectaron mutaciones relevantes en las regiones QRDR asociadas con resistencia a estos antibióticos (Redgrave et al., 2014). Una mutación observada fue Ser83→Ile en gyrA, en 3/7 muestras analizadas y Ser80→Leu en parC, en 4/7. Estas sustituciones han sido asociadas en la literatura con incrementos clínicamente relevantes en la concentración mínima inhibitoria (MIC, por sus siglas en inglés) frente a estos antibióticos, lo que sugiere una circulación de genotipos de Mg con potencial RAM en las granjas (Gautier-Bouchardon, 2018; Lysnyansky et al., 2008).
Por lo tanto, esto es un panorama preocupante ya que son genotipos que se podrían transmitir de manera vertical al encontrarse en aves reproductoras y en consecuencia, los pollitos al nacer, representarán un problema para la producción, no solo por ser una fuente de dispersión del micoplasma, sino por el riesgo de no responder a un tratamiento antibiótico en caso de enfermarse. Además, se debe tener en cuenta la transmisión horizontal por aves que posiblemente están enfermas, pudiendo representar igualmente riesgo de transmitir genotipos resistentes a las fluoroquinolonas (Mugunthan et al., 2023; Roberts y McDaniel, 1967), contribuyendo a hacer más complejo el problema.
Respecto a las muestras de Ms, en gyrA no se identificaron mutaciones asociadas a RAM, mientras que en parC se identificó Thr80→Ile en 5/7 muestras (71,4%). Este cambio se ha vinculado previamente con una disminución de susceptibilidad a enrofloxacina (Lysnyansky et al., 2013). Adicionalmente, estas muestras corresponden a nuevos genotipos y posiblemente, son cepas de campo que se encuentran circulando en el país. La predominancia de mutaciones en parC más que en gyrA coincide con reportes previos que señalan a parC como marcador principal de RAM en Ms (Bekő et al., 2020; Lysnyansky et al., 2013; Redgrave et al., 2014). Considerando que en Ms una única mutación en el gen parC puede ser suficiente para modificar la susceptibilidad a las fluoroquinolonas, las cinco muestras que presentaron el cambio Thr80→Ile, todas pertenecientes a nuevas ST, representan cepas de campo genéticamente distintas entre sí, con genotipos de resistencia a fluoroquinolonas.
De todas maneras, nuevamente se enfatiza en la necesidad de relacionar los genotipos con la presentación de signos clínicos y realizar pruebas de sensibilidad a antibióticos en las cepas, lo que quiere decir que el cultivo de Mycoplasma spp. debe realizarse. Aunque el cultivo es lento, los hallazgos de este estudio deberían compararse con información de fenotipos circulantes en la avicultura del país. Lo anterior se debe considerar porque la presencia de múltiples mutaciones en ambos genes suele ser necesaria para conferir resistencia clínicamente significativa a fluoroquinolonas (A. V. Gautier-Bouchardon, 2018). En este sentido, es fundamental avanzar hacia la implementación de métodos estandarizados tanto de MIC como moleculares de RAM para micoplasmas aviares, con el fin de poder obtener pruebas fenotípicas y genotípicas estandarizadas que se puedan replicar entre laboratorios, con el fin de mejorar las estrategias de diagnóstico y control de la enfermedad.
Referencias
Un aspecto importante de este estudio es que se realizó un muestreo por conveniencia a partir del banco de muestras del Laboratorio de Biología Molecular y Virología de la UNAL, el cual presta un servicio de diagnóstico, recibiendo muestras provenientes de zonas de alta producción avícola, lo cual podría ser una buena alternativa para tener una aproximación a la situación de diferentes agentes que circulan en las poblaciones avícolas en el país. Aunque, es necesario tomar en consideración el sesgo en la interpretación de los resultados teniendo en cuenta que, para este caso en particular, la mayoría de las muestras a las que se les realiza monitoreo de Mycoplasma spp. provienen de sistemas de producción de reproductoras y ponedoras comerciales, sin embargo lo anterior no resta relevancia ni importancia a los hallazgos obtenidos, los cuales aportan al conocimiento y son valiosos como insumo para evaluar estrategias de control y como estrategia para la vigilancia molecular de la circulación de Micoplasmas aviares en Colombia.
En este mismo sentido y para tomar decisiones basadas en el conocimiento, es necesario disponer de herramientas y métodos que permitan diferenciar cepas vacunales de cepas de campo, lo cual se evidencia en los resultados obtenidos que muestran que el uso de técnicas como MLST y secuenciación permite diferenciar cepas vacunales de cepas de campo lo cual contribuye a comprender mejor la diversidad genética de estos patógenos en poblaciones avícolas. Este conocimiento es clave para optimizar programas de bioseguridad, ajustar estrategias de vacunación, reducir el uso innecesario de antimicrobianos y establecer bases de datos para el monitoreo genético.
En cuanto a genotipos asociados con resistencia a antibióticos, el estudio destaca la importancia de caracterizar genéticamente los micoplasmas aviares en Colombia, considerando que estos microorganismos son naturalmente resistentes a antimicrobianos que actúan sobre la pared celular y que un uso inadecuado de los mismos favorece la aparición de resistencia. De esta manera los resultados obtenidos muestran por primera vez en el país la identificación de genotipos y mutaciones asociadas en los genes gyrA y parC (como los cambios Ser83→Ile y Thr80→Ile), constituyendo un primer paso hacia una vigilancia molecular.
Finalmente, este escenario resalta la necesidad de fortalecer los programas de vigilancia, monitoreo y bioseguridad dirigidos a ambos agentes. Los hallazgos evidencian la presencia de genotipos idénticos en diferentes tipos de muestras, así como la detección de combinaciones no registradas previamente en la base de datos PubMLST. Estos resultados subrayan la importancia de ampliar y actualizar la información disponible para optimizar la caracterización de microorganismos mediante la técnica MLST en estudios sobre Mycoplasma spp. y generar información que contribuya a la toma de decisiones en estrategias de control efectivas y eficientes bajo condiciones locales.
Agradecimientos
Agradecemos a la Asociación Colombiana de Médicos Veterinarios y Zootecnistas Especialistas en Avicultura (AMEVEA) por el apoyo brindado a través del Fondo de Apoyo a la Investigación Dr. Pedro Villegas Narváez – 2023, gracias al cual fue posible desarrollar este estudio. Este respaldo ha contribuido al fortalecimiento de la investigación nacional en el área de salud aviar y la resistencia a los antimicrobianos.
Referencias
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- Sara Forero Marin1
- Arlen P. Gomez1
- Magda Beltran León1
- Gloria Ramirez Nieto1*
1Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá DC, Colombia.
*Correo de correspondencia: gcramirezn@unal.edu.co
