Resumen
El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de una cepa probiótica de Bacillus licheniformis (DSM 28710; B-Act®) sobre el desempeño productivo y su capacidad para mitigar la enteritis necrótica (EN; inducida a partir de un desafío con Clostridium perfringens) en aves de corral. Se realizó una prueba en pollos de engorde, evaluando tres tratamientos durante 42 días bajo desafío inducido de EN; un grupo control negativo (dieta basal solamente); un grupo tratado con antibióticos (clorhidrato de oxitetraciclina (OXT), a dosis terapéutica de 105mg de OXT/litro en el agua de bebida durante tres días después del desafío de C. perfringens); y un grupo tratado con B-Act® (500g de B-Act®/tonelada de pienso, igual a 1,6×1012 unidades formadoras de colonias de B. licheniformis DSM 28710/tonelada de pienso, suplementado desde el principio hasta el final). A pesar del desafío inducido de EN, las ganancias de peso de los grupos con B-Act® y OXT fueron similares entre sí, pero significativamente más altos en comparación con el grupo control negativo al final del estudio (P<0.05). El aumento de peso del grupo B-Act® ya fue significativamente mayor en comparación con el control negativo al día 21 (P<0,05), lo que indica un beneficio potencial del probiótico incluso antes del establecimiento clínico de EN. Los valores de conversión alimenticia (CA) siguieron un patrón similar a lo largo del estudio, con una CA general significativamente menor para el Grupos B-Act® y OXT comparados con el control negativo (P<0,05; d0-42). Las aves alimentadas con B-Act® tuvieron puntuaciones significativamente más bajas de lesiones de EN (P<0.05), en comparación con el grupo control negativo y OXT en el día 21, aunque la OXT no se suplementó con los animales en esta etapa todavía. Tanto los grupos B Act® como OXT tuvieron puntuaciones de EN significativamente más bajas que el control en el día 28 (P<0,05), demostrando la eficacia del tratamiento antibiótico y el efecto atenuante de B-Act® sobre los efectos de Clostridium perfringens al inducir un desafío de EN.
W. Van der Veken1*, V. Hautekiet1, E.A. Kimminau2, C. Hofacre3 and G.F. Mathis4
1Huvepharma NV, Uitbreidingstraat 80, 2600 Antwerp, Belgium; 2Huvepharma Inc., 525 Westpark Drive, Suite 230, Peachtree City, GA 30269, USA; 3Southern Poultry Research Group, 1061 Hale Road, Watkinsville, GA 30677, USA; 4Southern Poultry Research Inc., 96 Roquemore Road, Athens, GA 30677, USA.
wouter.vanderveken@huvepharma.com
Palabras clave:
Probiótico, B-Act®, enteritis necrótica, aves de corral, rendimiento, salud intestinal
1. Introducción
Las enfermedades gastrointestinales clínicas y subclínicas en los pollos de engorde pueden provocar grandes pérdidas económicas, un bienestar deficiente y una reducción en la rentabilidad en la granja. La enteritis necrótica (EN) es un ejemplo, siendo Clostridium perfringens el agente causal en el inicio y desarrollo de la enfermedad. C. perfringens es una bacteria grampositiva, formadora de esporas, anaerobia y se encuentra normalmente en niveles de menos de 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/g de contenido intestinal en aves sanas (Caly et al., 2015). Como tal, se puede clasificar como un patógeno oportunista, que solo causa EN si las condiciones para el sobrecrecimiento bacteriano son óptimas (Williams, 2005).
Factores estacionales y ambientales tienen impacto en la ocurrencia de EN, así como factores predisponentes, pero no limitado a – nutrición (incluyendo fuentes de proteínas y formas de presentación fica del alimento), la presencia de coccidiosis, estrés y potenciales causas de inmunosupresión (M’Sadeq et al., 2015). Todos estos factores pueden fomentar el crecimiento de C. perfringens, resultando en un aumento de las toxinas producidas por estas bacterias. En consecuencia, se desarrolla un riesgo grave para la salud intestinal, que incluye la Integridad de la pared intestinal (Antonissen et al., 2016). Cuando esto sucede, el término EN se utiliza para describir la enfermedad resultante, caracterizada por necrosis e inflamación del sistema digestivo. La EN a menudo se caracteriza por lesiones intestinales, rendimiento de crecimiento significativamente reducido, bienestar animal disminuido y aumento de la mortalidad (hasta un 50% en casos clínicos; Timbermont et al., 2011).
Unos factores adicionales que contribuyen a la aparición de EN han sido las limitaciones y prohibiciones impuestas al uso de antibióticos utilizados en la alimentación, utilizados en concentraciones subterapéuticas (Casewell et al., 2003). Esto fue resaltado aún más por un estudio epidemiológico en Noruega por Kaldhusdal et al. (2016), demostrando que la eliminación de dichos antibióticos en la alimentación en algunas de las parvadas de pollos de engorde monitoreadas dio lugar a una mayor incidencia de colangiohepatitis relacionada con mortalidad. Este indicador post mortem de EN aumentó de menos del 5% a casi el 10% en este estudio, en contraste con la tendencia a la baja observada durante la anterior década. A nivel económico, la pérdida global total como consecuencia de los brotes de EN, se ha estimado previamente ser más de 2.000 millones anuales (Van der Sluis, 2000), con cifras más recientes que acercan la estimación anual a 6.000 millones de dólares (Wade y Keyburn, 2015). En un esfuerzo por contrarrestar estas pérdidas, se han desarrollado varios aditivos zootécnicos para piensos, para ayudar a prevenir el desarrollo de EN en parvadas avícolas (M’Sadeq et al., 2015). Un interesante ejemplo de estos son los probióticos, microorganismos viables que, cuando son administrados en cantidades adecuadas, confieren beneficios de salud al anfitrión (FAO/OMS, 2002). Su modo de acción es a menudo complejo, con beneficios provenientes de la competencia frente a los patógenos por nutrientes o espacios físicos, produciendo compuestos beneficiosos, aumentando la digestión y/o absorción de nutrientes, mejorando la función de barrera intestinal, reduciendo la inflamación intestinal y/o interactuando con el sistema inmunológico o una combinación de los anteriores (FAO, 2016).
Un ejemplo de un género bien conocido de probióticos es Bacillus, que tiene una larga historia en producción animal, y se ha utilizado principalmente para apoyar la salud y el funcionamiento correcto del tracto gastrointestinal (Elshaghabee et al., 2017). Una especie de ese género en particular, Bacillus licheniformis, es de especial interés en lo que respecta a la mitigación de EN. Se ha demostrado que la especie es antagónica tanto in vivo como in vitro contra C. perfringens (Barbosa et al., 2005; Mingmongkolchai y Panbangred, 2018), restringiendo uno de los principales factores en el inicio y la gravedad de la EN en aves de corral. Esto está respaldado por investigaciones previas, en las que los probióticos a base de B. licheniformis han sido reconocidos como probióticos efectivos para mitigar los desafíos entéricos (Simon et al., 2001). Un análisis más reciente de esta especie lo destacó esto aún más, confirmando su capacidad para reducir los efectos negativos causados por la EN en el equilibrio de la microbiota intestinal de los pollos (Xu et al., 2018). Los beneficios mencionados anteriormente están vinculados al modo de acción de B. licheniformis, que se considera multifactorial y se basa en el concepto de exclusión competitiva. Este concepto implica no solo la competencia directa e indirecta por los nutrientes y los sitios de unión física en el intestino, sino también la producción de compuestos antimicrobianos y la mejora de la actividad del sistema inmunológico (Bernardeau et al., 2017; Caly et al., 2015; Deng et al., 2012; Dischinger et al., 2009).
Sobre la base de la investigación disponible, esta especie probiótica se ha comercializado en los últimos años: B-Act® (Huvepharma, Sofía, Bulgaria) es un buen ejemplo, utilizando una sola cepa específica de B. licheniformis (DSM 28710) en su formulación. El producto probiótico se comercializa a nivel mundial, incluido un registro europeo para su uso en aves de corral (EFSA, 2016, 2019), con una dosis efectiva de 1,6×109 UFC por kg de alimento. En el siguiente estudio en pollos de engorde, se investigó la eficacia de B-Act® sobre el desempeño en crecimiento y la mitigación de EN, después de inducir un desafío de EN por C. perfringens. Todos los animales recibieron el mismo desafío de EN y se dividieron en tres grupos de tratamiento: un grupo control no tratado (dieta basal solamente), un grupo probiótico (dieta basal + 500 g B-Act®/tonelada de alimento) y un grupo tratado con antibiótico (dieta basal + dosis terapéutica de clorhidrato de oxitetraciclina (OXT) a través del agua de bebida, igual a la dosis mínima de 22,5 mg de OXT/animal/día).
2. Materiales y métodos
Aves y alojamiento
Un total de 1.200 pollos de engorde machos sanos de un día, cobb 500 de la planta de incubación Cobb-Vantress (Cleveland, GA, USA) fueron transportados a la granja de investigación experimental (Atenas, GA, EE.UU.). Los animales fueron pesados y asignados al azar a 24 corrales, con pesos corporales iniciales que promediaron 49 g. Hubo tres grupos de tratamiento, cada uno con ocho corrales de 50 aves, dando un total de 400 aves por tratamiento. Cada corral tenía un área de superficie de 4,65 m2 por corral, que contenía aproximadamente 10 cm de cama reutilizada con una capa superior de virutas de pino fresco. Esto fue para simular condiciones comerciales donde la cama se reutiliza entre parvadas de pollos de engorde, que es una práctica común en los Estados Unidos. El ensayo utilizó sistemas de manejo que imitaban las condiciones comerciales lo más cerca posible. La temperatura en el galpón se optimizó mediante el uso de cortinas laterales (sin ventilación de túnel) de acuerdo con la edad de las aves. Inicialmente, la temperatura en el galpón oscilaba entre 30-32°C, que luego se redujo en el tiempo a 23-27°C (monitoreado diariamente). Se utilizaron bombillas fluorescentes encima de cada corral para la iluminación, con luz de 24 horas desde el día 1 hasta el día 14, y 18 horas de luz desde el día 15 hasta el día 42. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con los principios y directrices específicas para la ética y el bienestar de los animales, de conformidad con la Federación de Sociedades de Ciencia Animal (FASS).
Dietas y tratamientos
El agua y el pienso estuvieron disponibles ad libitum durante todo el período de prueba. Se utilizó una dieta basal comercial, basada en maíz y torta (pasta) de soja, y formulada para cumplir con los requisitos comerciales de Cobb (2016). Esta dieta basal se ofreció a los animales en tres fases de alimentación (iniciador del día 0 al 21; engorde del día 21 al 35; finalizador del día 35 al 42) durante todo el período de prueba. La fase de arranque se ofreció en migajas (crumble) e inicialmente se suministró utilizando una bandeja, colocada encima de la cama en cada corral hasta el día 7. A partir del día 8, la dieta se peletizó y se alimentó a través de un alimentador tipo tubo (uno por corral). La Tabla 1 muestra la formulación de la dieta basal para cada fase de alimentación. La Tabla 2 muestra el análisis de nutrientes para cada fase de alimentación.
Se evaluaron tres tratamientos, con un primer grupo que sirvió como control negativo y recibió la dieta basal solamente (grupo control). El segundo grupo fue alimentado con la misma dieta basal, pero suplementada con 500 g de B-Act® por tonelada de alimento (B. licheniformis DSM 28710, Huvepharma®; Grupo B-Act®). Esto equivalía a 1,6×1012 ufc B. licheniformis por tonelada de pienso y se ofreció de forma continua a lo largo de las tres fases de alimentación, desde el día 0 hasta el día 42. El tercer grupo también fue alimentado con la dieta basal del control, pero recibió una dosis de tratamiento de 105 mg de OXT por litro de agua potable (Oxytet® soluble, número de lote TSH60008, Huvepharma®; Grupo OXT). El antibiótico se suministró a través del sistema de agua desde el día 21 hasta el día 24 (después del desafío de C. perfringens). Según la ingesta de agua y el peso corporal, el tratamiento OXT se correspondió con la dosis mínima recomendada de 22,5 mg OXT/animal/día (de acuerdo con las recomendaciones de la etiqueta del producto).
Desafío
El día de la eclosión, todas las aves fueron vacunadas contra coccidiosis por aerosol con una vacuna de ooquistes vivos a la dosis recomendada en la etiqueta. (Coccivac-B52® utilizada para el manejo de la coccidiosis, Merck Animal Health, Madison, NJ, EE.UU.) predisponiendo a los animales a EN a una edad posterior. Posteriormente todas las aves fueron desafiadas con C. perfringens los días 19, 20 y 21. La cepa # 6 de C. perfringens se ha utilizado en estudios previos y se aisló de una operación comercial local de pollos de engorde, conocida por haber causado EN en el pasado (Hofacre et al., 2003). Cada corral recibió la misma cantidad de inóculo (1 ml/ave, 50 ml/corral), mezclado en el alimento en la base del tubo alimentador. Se preparó inóculo fresco para cada día de desafío, con niveles de titulación de 1.0×108-9 ufc/ml.
Mediciones
Todas las aves se pesaron individualmente el día de la eclosión y luego se pesaron por corral los días 21, 35 y 42, para calcular el aumento de peso corporal promedio (PCP). La ingesta de alimento (IA) se registró en los mismos días por corral, lo que permitió calcular la relación de conversión de alimento (CA) para cada fase de crecimiento. Los corrales se revisaron diariamente para detectar la mortalidad y no se reemplazaron las aves durante el estudio. Las aves solo fueron sacrificadas para aliviar cualquier sufrimiento y se registraron todas las muertes. Cualquier ave sacrificada fue pesada y la CA fue corregida por mortalidad. Se realizó necropsia en todas las aves muertas o sacrificadas, para determinar la causa probable de la muerte. Se realizaron observaciones dos veces al día del estado general de parvada, incluida la disponibilidad de alimento y agua, la temperatura, cualquier condición inusual y cualquier comportamiento anormal de las aves.
Los días 21 y 28, cinco aves de cada corral fueron seleccionadas al azar, sacrificadas mediante luxación cervical, pesadas y examinadas para detectar lesiones de EN. Esto se basó en el sistema de puntuación de lesiones de Hofacre et al. (1998); puntuación 0: normal; puntuación 1: moco leve que cubre el intestino delgado; puntuación 2: mucosa intestinal yeyunal necrótica; 3: desprendimiento de mucosa y contenido del intestino delgado con sangre. En el día 42 del estudio, las aves restantes fueron pesadas por corral y sacrificadas.
Análisis estadístico
Las puntuaciones de las lesiones, PCP, IA, CA, EN y mortalidad (total y relacionada con EN) se registraron o calcularon, y posteriormente fueron analizadas. Se corrigieron los cálculos pertinentes para los fallecidos o aves sacrificadas. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa STATISTIX 10 para Windows (Software analítico, Tallassee, FL, Estados Unidos). Los datos se distribuyeron normalmente y, como tales, se analizaron mediante ANOVA, con las medias resultantes separadas utilizando la diferencia menos significativa de Tukey, a un nivel de significancia de P<0,05.
- Resultados con diferente letra superíndice son significativamente diferentes (P<0.05).
- control: dieta basal; B-Act: dieta basal + 500 g B-Act/ton de alimento (1.6×1012 ufc Bacillus licheniformis/ton de alimento), inicio hasta finalizador; OXT: dieta basal + dosis tratamiento de 105 mg OXT/l de agua de bebida, suplementado vía agua de bebida desde el día 21 al día 24.
3. Resultados
Las mediciones de rendimiento de los tres grupos en términos de IA, CA y PCP se muestran en la Tabla 3.
En la primera fase, la IA no fue diferente entre los grupos de tratamiento (d0-21; P>0.05). Sin embargo, al desafiar a las aves con C. perfringens en la siguiente fase (d19-21) influyó fuertemente en la IA, con valores significativamente más bajos fueron el grupo control en comparación con los grupos B-Act® y OXT (d0-35; P<0.05). Teniendo en cuenta la duración total del ensayo (d0-42), el grupo control tuvo una IA significativamente menor que el grupo B-Act®, y la IA del grupo OXT no fue significativamente diferente a los otros dos grupos (P<0,05; Tabla 3).
La CA del grupo B-Act® fue significativamente inferior a la de los otros dos grupos de tratamiento en la primera fase, lo que indica una ventaja de agregar el probiótico a la dieta desde el principio (P<0,05; d0-21). A pesar del desafío de C. perfringens en el final de la primera fase, la CA para los grupos B-Act® y OXT fueron similares cuando se evaluaron de d0 a d35: ambos fueron significativamente más bajos que el grupo control (P<0,05; d0-35). Las tres dietas tuvieron valores de CA significativamente diferentes cuando se evaluaron durante todo el período de prueba, con el grupo OXT logrando la CA más baja, mientras que el grupo control observó la CA más alta (P<0.05; d0-42; Tabla 3).
El grupo control tuvo un PCP significativamente más bajo al final de la primera fase en comparación con el grupo B-Act® (d21; P<0.05). Después del desafío de C. perfringens en los dos grupos B-Act® y OXT, El PCP fue significativamente más alto que el grupo control, con valores similares al compararlos entre sí (P<0,05; d35; Tabla 3).
Además del rendimiento del crecimiento, la Figura 1 ilustra el efecto de los tratamientos de control, B-Act® y OXT sobre la mortalidad para el período de prueba completo.
Los grupos B-Act® y OXT tenían mortalidad significativamente menor que la del control (P<0,05), tanto en términos de mortalidad asociada a EN como mortalidad en general. La mortalidad incluida por otras razones distintas a la EN, mostró desafíos típicos para la producción moderna de pollos de engorde, tales como Síndrome de muerte súbita (SMS), onfalitis, aerosaculitis y así sucesivamente.
La Figura 2 muestra las puntuaciones de las lesiones de EN los días 21 y 28. Las aves en el grupo B-Act® tenían puntuaciones de lesiones significativamente (P<0,05) más bajas que los otros dos grupos de tratamiento en el día 21, ya que el grupo OXT aún no se había tratado en esta etapa. En el día 28, las puntuaciones de las lesiones de los grupos OXT y B-Act® fueron similares, siendo ambas puntuaciones más bajas que en el grupo control (P<0,05).
4. Discusión
Los resultados presentados aquí están en línea con estudios anteriores de B. licheniformis Knap et al. (2010) realizaron tres ensayos, encontrando que la alimentación de B. licheniformis a pollos de engorde desafiados con C. perfringens podría mitigar los efectos negativos del desafío en el rendimiento, mortalidad por EN y puntuaciones de lesiones de EN. También incluyeron tratamientos con niveles subterapéuticos de virginiamicina (aplicación como promotor del crecimiento, 15 g/tonelada de pienso), registrando resultados similares en cuanto a los grupos de B. licheniformis en los ensayos. La investigación de Zhou et al. (2016) apoya estos hallazgos, además, utilizando un modelo de desafío similar (vacuna contra la coccidiosis seguida de inoculación por C. perfringens): se reportaron aumento de ganancia de peso y mejora de CA para los grupos alimentados con el probiótico B. licheniformis, al nivel de ser estadísticamente iguales que el grupo de control no desafiado. Finalmente, Lin et al. (2017) también encontraron resultados comparables en una prueba de desafío diseñada de forma similar, en las aves suplementadas con B. licheniformis lograron un crecimiento estadísticamente similar al de los animales del grupo control no desafiados. Como tal, el potencial para el probiótico B. licheniformis para apoyar el rendimiento técnico de los animales bajo diferentes desafíos pudo ser demostrado.
Las mejoras en las puntuaciones de las lesiones de EN en las aves suplementadas con B. licheniformis, agregan peso al tema de la integridad intestinal y estructuras epiteliales, como se investigó anteriormente. Por ejemplo, Deng et al. (2012) encontraron que las gallinas ponedoras, mantenidas bajo estrés por calor y suplementadas con B. licheniformis, había mejorado las estructuras de las vellosidades y el rendimiento del crecimiento en comparación con los animales de control no suplementados y criados en las mismas condiciones. Como las estructuras de vellosidades en condiciones adecuadas aseguran un funcionamiento óptimo del tracto gastrointestinal, juegan un papel clave, papel en la absorción de nutrientes y, por lo tanto, en el rendimiento del crecimiento. Otros ensayos comparables mostraron respuestas similares, donde la suplementación de dietas con B. licheniformis apoyó las estructuras de las vellosidades, mejoró el rendimiento del crecimiento y redujo las puntuaciones de las lesiones de EN (Lei et al., 2013; Lin et al., 2019).
Los niveles de mortalidad más altos reportados en el estudio actual, no fueron tan grandes como se hubiera esperado para un mayor desafío de EN, donde se han reportado niveles del 50% (Timbermont et al., 2011). Sin embargo, con el probiótico B. licheniformis DSM 28710 la mortalidad sigue siendo significativamente reducida en comparación con el grupo de control de desafío, ambos en términos de mortalidad asociada a EN, así como la mortalidad general.
Además de estar en línea con la investigación que demuestra la eficacia de las especies probióticas, los resultados actuales también confirman trabajos anteriores realizados específicamente con B. licheniformis DSM 28710 (B-Act®), evaluada por la EFSA en 2016 y 2019.
5. Conclusiones
Este ensayo demuestra que la alimentación con probióticos B-Act® lleva a parámetros de rendimiento de crecimiento significativamente mejorados de pollos de engorde bajo un desafío de EN. Además, los puntajes de lesiones de EN fueron significativamente más bajos para los animales suplementados con B-Act®, así como la mortalidad general y la relacionada con EN. Los resultados obtenidos con la administración profiláctica de B-Act® fueron comparables con los tratamientos realizados con dosis terapéuticas de OXT. Como tal, la administración continua de B-Act® tiene el potencial de ser una herramienta útil y práctica para mitigar la EN en pollos de engorde comerciales, contribuyendo también a la reducción en el uso de antibióticos en la granja.
- Premix de minerales traza al 0.075% aportando lo siguiente (por kg de dieta): manganeso (MnSO4•H2O), 60 mg; hierro (FeSO4•7H2O), 30 mg; zinc (ZnO), 50 mg; cobre (CuSO4•5H2O), 5 mg; iodio (ethylen diamina dihydroiodado), 0.15 mg; selenio (NaSe03), 0.3 mg.
- Premis de vitaminas al 0.05% aportando lo siguiente (por kg de dieta): vitamina A, 8,818 IU; vitamina D3, 2,480 IU; 25-hydroxyvitamina D3, 69 µg; vitamina E, 35 IU; vitamina B12 (cobalamina),15.5 µg; biotina, 0.17 mg; menadiona, 1.98 mg; tiamina, 1.87 mg; riboflavina, 7.7 mg; acido D-pantotenico 13.23 mg; vitamina B6, 3.3 mg; niacina 44.1 mg; acido folico, 1.1 mg.
