Resumen
Existen diferentes causas que pueden llevar a la disminución de la fertilidad en parvadas de reproductores pesados, tales como; la genética, la nutrición, condiciones ambientales, la influencia hormonal, la edad y la condición corporal. El objetivo de este estudio fue determinar si factores como el peso y la edad del gallo puede influir de manera significativa en el conteo de agujeros formados por los espermatozoides a través de la prueba de permeabilidad espermática in vivo en machos reproductores estirpe Ross AP 308 clasificados por categoría de peso como livianos, intermedios y pesados de 31 y 52 semanas de edad, en condiciones de granja. No se evidenciaron diferencias estadísticas significativas entre los diferentes rangos de pesos y edades. No obstante, se presentaron diferencias numéricas que sugieren que los huevos fértiles provenientes de machos de peso intermedio cuentan con un número promedio de orificios en la membrana perivitelina interna mayor, seguido de los machos pesados y en último lugar, los livianos.
Palabras clave: reproductores pesados, fertilidad, espermatozoides, prueba de permeabilidad espermática in vivo.
Introducción
El objetivo de los reproductores pesados es producir el mayor número posible de huevos fértiles capaces de dar lugar a un pollo de engorde de buena calidad. Lamentablemente, la selección genética realizada para producir pollos de engorde cada vez más eficientes ha llevado a que la fertilidad vaya en descenso en los últimos años. Sin embargo, la baja fertilidad de los reproductores pesados también se ha asociado a otros factores como la edad, la influencia hormonal, la condición corporal, entre otras (Fragoso, et al., 2012). Debido a esto, resulta importante monitorear y establecer pruebas de fertilidad con el fin de detectar problemas a futuro que puedan poner en riesgo el número de nacimientos de la progenie.
Una de las pruebas aplicadas en avicultura para el monitoreo de fertilidad es la prueba de permeabilidad espermática in vivo desarrollada en 1990 por la Universidad de Georgia (Khan, 2018). Dicha prueba evalúa la capacidad de los espermatozoides de unirse al disco germinal, penetrar la membrana perivitelina interna y de esta forma, fecundar el óvulo (Bramwell, 1998). De forma indirecta, es capaz de, en el caso del macho, evaluar la concentración y la calidad espermática, el comportamiento sexual y la frecuencia de montas efectivas. De igual forma, en el caso de la hembra, evalúa la calidad del sistema reproductivo (Gumułka y Kapkowska, 2005).
La membrana perivitelina interna, equivalente a la zona pelúcida en mamíferos, es una estructura proteica y fibrosa acelular cuyos componentes son sintetizados por las células de la granulosa de los folículos ováricos y por el hígado (Ichikawa, et al. 2016). Dicha membrana rodea el ovocito al momento de la ovulación (Bakst, 2014). En su superficie, se encuentran glicoproteínas como ZP1, ZP3, ZP4, ZPD y ZP2 (esta última, localizada específicamente en el disco germinal) y N-glucanos que facilitan la unión de los espermatozoides y permiten su integración hacia el interior del óvulo. También,
en esta zona del disco, se encuentra presente la información genética de la hembra, lo que permite la fusión inmediata de los gametos femenino y masculino (Ichikawa, 2016).
Inicialmente, los espermatozoides ascienden hasta el infundíbulo desde la cloaca en búsqueda del óvulo a fecundar, se unen a este a través de glicoproteínas específicas que estimulan la fusión de la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa, la liberación de acrosina y, por ende, la lisis de la membrana perivitelina interna. De esta forma, el espermatozoide aviar ingresa al óvulo y une su material genético con el de la hembra (Hirohashi, y Yanagimachi, 2018).
A causa de la penetración y la polispermia fisiológica, se da la formación de múltiples agujeros en la membrana perivitelina. La lectura de la prueba de penetración espermática en huevos consiste en contabilizar el número de agujeros presentes en la región del disco germinal.
Según Bramwell (1998) un número de orificios reducido se asocia a una baja fertilidad y/o mortalidad embrionaria temprana puesto que indica un reducido número de espermatozoides, envejecimiento y pérdida de calidad espermática, así como disminución del factor activador de oocitos. Por otro lado, un alto conteo se asocia a una adecuada fertilidad y calidad embrionaria. De igual forma, este mismo autor sugiere que el promedio mínimo debe ser igual o mayor a 30 orificios para mantener un adecuado porcentaje de fertilidad.
El objetivo de este trabajo fue determinar si factores como el peso y la edad del gallo puede influir de manera considerable en el conteo de agujeros formados por los espermatozoides a través de la prueba de permeabilidad espermática in vivo en machos reproductores livianos, intermedios y pesados de la raza Ross AP 308 de 31 y 52 semanas de edad en condiciones de granja.
Materiales y métodos
El estudio se realizó en una granja de reproductores pesados ubicada en Ibagué, Tolima y se contó con el apoyo del Laboratorio de Patología Aviar de la Universidad Nacional de Colombia.
Para hacer una comparación efectiva del efecto del peso del macho sobre la capacidad fertilizante, previamente a la toma de los huevos, se realizó la clasificación de los machos en 7 diferentes rangos de peso (grading), dónde 0 es el grupo de machos más livianos y 6 el más pesado. Para aplicar la prueba, se eligieron los machos de peso 1 (livianos), peso 3 (intermedios) y 5 (pesados), puesto que los machos peso 0 y 6 no son emparejados con las hembras. En el caso de los machos de 31 semanas los rangos de peso fueron de 3740 a 3940 g, 3140 a 4340 g y 4540 a 4740 g en pesos 1, 3 y 5, respectivamente. Por otro lado, los rangos de peso para los gallos de 52 semanas de edad fueron de 4050 a 4450 g para peso 1, 4900 a 5350 g para peso 3 y 5800 a 6250 g para peso 5.
Los machos fueron distribuidos en diferentes corrales teniendo en cuenta la diferencia porcentual de peso de las hembras con respecto al indicado en la tabla de manejo, con el fin de emparejar machos y hembras con una condición corporal similar.
La proporción entre hembras y machos fue de 11 hembras/macho y 8 hembras/macho para la edad de 31 y 51 semanas, respectivamente. Fueron recolectadas 4 muestras de los diferentes corrales durante 5 días a partir de los 10 días de haber realizado el grading (es decir, 20 huevos por peso y 60 huevos en total) y fueron procesadas conforme se iban recolectando. Para el procesamiento de las muestras se utilizó la técnica planteada por Bramwell (1990) con una serie de modificaciones:
- Separación física de la albúmina y yema con ayuda de toallas de papel limpias y húmedas en NaCl al 0,9% utilizando la técnica de rolling.
- La yema es sumergida en solución de NaCl al 0,9% durante 15 a 30 minutos con el fin de eliminar los restos de albúmina y de chalaza.
- Se realiza un corte de aproximadamente 1 cm2 alrededor del disco germinal con la ayuda de tijeras punta aguda pequeñas y pinzas sin garra y se lava nuevamente en la solución de NaCl.
- El segmento del disco germinal retirado se extiende en una lámina portaobjetos con ayuda de dos agujas.
- Se fija el tejido a la lámina con 3-5 gotas de formol al 20% por aproximadamente 5 minutos.
- Después de retirar el exceso de formol se procede a realizar la tinción con varias gotas de ácido peryódico de Schiff durante 1 minuto.
- Sobre el tejido fijado y teñido, se posiciona una lámina cubreobjetos que es cubierta en sus bordes por esmalte transparente.
Posteriormente, las láminas fueron evaluadas en un microscopio de campo claro a un aumento de 40x para realizar el respectivo conteo (Figura 2).
Por otro lado, en el caso de los machos de 52 semanas, se realizó una prueba de fertilidad rápida en los diferentes pesos. Esta prueba consistió en recolectar 30 huevos de cada corral e incubarlos a 38º C durante 7 días en la granja con el fin de evaluar la presencia de estructuras compatibles con desarrollo embrionario y determinar el porcentaje de fertilidad de cada uno de los pesos a evaluar.
Todos los datos fueron almacenados en una base de datos de Excel y para la evaluación estadística se aplicó un análisis de varianza tipo ANOVA.
Resultados y discusión
Al correr la prueba estadística no se evidenciaron diferencias significativas, pero sí diferencias numéricas entre los pesos con un comportamiento similar en las dos edades. El mayor conteo de agujeros se presentó en los machos de peso intermedio, seguido del pesado y el liviano (Figura 3).
Estos hallazgos concuerdan con los reportados en la literatura, según Sarabia, et al. (2012), en machos con una subcondición corporal donde la producción espermática se puede ver reducida a causa de la hipoplasia testicular y los altos niveles de corticoides endógenos presentes en estos animales. De igual forma, los bajos niveles de testosterona influyen en el comportamiento sexual disminuyendo la libido y, por ende, el número de montas.
Por otro lado, el conteo de agujeros por penetración espermática en el macho pesado tiende a ser más bajo que un macho intermedio, a causa de la dificultad que representa el ejecutar la monta debido a su contextura física (Wilson, et al. 2018). Es bien sabido que un macho activo es capaz de realizar alrededor de 30 cópulas/día (Urízar, 2018).
De igual manera, una condición corporal muy alta favorece la aparición de enfermedades como discondroplasia, desgaste articular, así como ruptura de ligamentos y tendones, condiciones que afectaran directamente y de forma negativa la cópula (Sarabia, et al 2018).
Otro aspecto a considerar es que, si bien el peso corporal tiene una relación directa con el peso testicular (Urízar, 2018), machos con una condición corporal alta que hayan sido sometidos a un protocolo de alimentación restringido tienen el riesgo de sufrir atrofia testicular, lo que causaría directamente reducción de la calidad y la cantidad de producción espermática.
A diferencia del macho liviano y pesado, el macho con un peso intermedio en las dos edades a evaluar cuenta con el mayor número de agujeros promedio. Sugiriendo que, los machos de peso intermedio cuentan con mejores parámetros de fertilidad.
Por otro lado, al comparar el número total de agujeros por edad, se evidencia que los machos más adultos tienen un conteo mayor a diferencia de los machos de 31 semanas (Figura 4). Sin embargo, al aplicar el análisis de varianza, no se encuentran diferencias significativas entre las edades.
Según Bramwell en 1998 y varios investigadores, la fertilidad de los machos disminuye conforme va envejeciendo, principalmente desde la semana número 44. Esto se atribuye al proceso de contracción testicular que como consecuencia reduce la calidad y la concentración de los espermatozoides y los niveles de testosterona. Otros autores también sugieren que este fenómeno se puede atribuir a un cambio en la composición lipídica de la membrana celular de los espermatozoides (Gumułka y Kapkowska, 2005).
No obstante, la hembra también puede afectar de manera considerable los valores de penetración espermática, ya que, esta prueba además de evaluar indirectamente la capacidad de los túbulos de almacenamiento espermático (SST) ubicados en la unión uterovaginal de las aves, también evalúa el microambiente de esta zona y la capacidad del sistema reproductivo de movilizar fracciones de semen hacia el infundíbulo para que se dé la fertilización (Gumułka y Kapkowska, 2005).
Se ha reportado que gallinas adultas disminuyen el espacio de almacenamiento de los SST y el microambiente se torna hostil para los espermatozoides, reduciendo así la cantidad de células sexuales disponibles para unirse y penetrar la membrana perivitelina interna (Brillard y Antoine, 1990). Por otro lado, otros autores sugieren que conforme avanza la edad, el número de receptores ubicados en el óvulo para el anclaje de los espermatozoides va disminuyendo progresivamente (Santos, et al., 2012).
En el caso de la prueba de fertilidad rápida que se realizó en el lote de 52 semanas de edad, se evidenció que el porcentaje de fertilidad más alto se presentaba en los machos de peso intermedio con un 93,3%, mientras los livianos obtuvieron un porcentaje de 90% y los pesados de 66,7% (Figura 5).
Al comparar el porcentaje de fertilidad con la media de agujeros en el disco germinal en los diferentes pesos, se evidencia que son los machos de peso intermedio quienes tienen un mayor porcentaje de fertilidad, así como un mayor número de agujeros.
No obstante, llama la atención que el menor porcentaje de fertilidad se evidencia en el grupo de animales pesados (Figura 6). Pues, es de esperarse que los machos con mayor condición corporal al tener un mayor número promedio de agujeros en la membrana perivitelina tengan por tanto un porcentaje de fertilidad mayor que los machos livianos.
Estos hallazgos de porcentaje de fertilidad se pueden atribuir, como se mencionó anteriormente, a que la excesiva condición corporal impide al macho pesado adoptar la posición adecuada para llevar a cabo el conocido ‘’beso cloacal’’. Por lo tanto, así haya una adecuada cantidad y calidad en producción espermática, no hay ingreso constante de espermatozoides jóvenes, lo que causaría el envejecimiento y pérdida de calidad de los espermatozoides almacenados en los SST, factor que se asocia a mortalidad embrionaria temprana.
Por otro lado, los machos livianos a pesar de que se sabe que la calidad de su semen es reducida, la frecuencia de montas efectivas probablemente sea más alta que la de los machos pesados, razón por la cual el porcentaje de fertilidad del corral de machos con subcondición corporal es mayor.
Y, como se esperaba, es el corral de machos de peso intermedio el que tiene un porcentaje de fertilidad mayor con respecto a los otros, debido a la calidad de su semen, comportamiento sexual y frecuencia de montas.
Conclusiones
La prueba de permeabilidad espermática in vivo permite hacer una predicción del comportamiento de la fertilidad de una parvada en el futuro. Es una prueba sencilla y económica que evalúa no solo la capacidad del espermatozoide de penetrar la membrana perivitelina interna sino también de forma conjunta la calidad fertilizante del macho reproductor, así como del sistema reproductivo de la hembra.
A pesar de que no se evidenciaran diferencias significativas entre los diferentes pesos a evaluar y los valores de penetración espermática, fue posible realizar una comparación de los resultados numéricos con los reportados en la literatura. En donde, los machos de pesos intermedios cuentan con un potencial reproductivo mayor y, por ende, un conteo de penetración espermático superior en comparación con los machos livianos y pesados. Es por esto que resulta importante realizar desde la cría un adecuado manejo de la alimentación en los machos con el fin de evitar la sub y sobre condición.
No obstante, es de resaltar que la muestra a evaluar fue reducida debido al daño de los huevos durante el procesamiento o por su descarte al no ser fértiles. Es por esto que se plantea para un próximo estudio procesar un mayor número de muestras y complementar con una evaluación de calidad espermática que comprenda; concentración, motilidad y morfología.
Conclusiones
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- Bakst, M. R., Eastridge, J., & Malecki, I. A. (2014). The inner perivitelline layer sperm hole assay: Use of filter paper rings for the isolation of the perivitelline layer overlying the germinal disc and new observations on its morphology. The Journal of Applied Poultry Research, 23(1), 121–128. doi:10.3382/japr.2013-00873
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